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96孔板微生物法測定血液中葉酸操作方法

更新時間:2018-09-11  |  點擊率:1495

96 孔板微生物學(xué)法微量測定葉酸是葉酸測定方法的重大改進(jìn), 這使測定時間大為縮短。原來試管法需時 36~48h,現(xiàn)縮短為 16~18h,而且這一方法更為、靈敏、簡便。 96孔板葉酸測定使用量更微,測試樣本量大、重復(fù)性好,適用于大批量樣本的檢測研究。下面介紹一種96孔板法測定血液中葉酸含量的操作方法[1]。

 

葉酸生長培養(yǎng)基

取4.7 g葉酸培養(yǎng)基加入到 100 mL蒸餾水中煮沸,冷卻后加入氯霉素 0.05 g、抗壞血酸0.75 g,每20 mL分裝于培養(yǎng)管中,保存于-80℃ 。

 

菌株

將 1 支凍干乳酸桿菌氯霉素耐藥株接種于20 mL葉酸生長培養(yǎng)基充分搖勻后,置于 37℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,取1 mL 接種于另一個20 mL 新鮮生長培基傳代培養(yǎng),得到對數(shù)生長期的菌液,與 80% 的甘油等體積混合,每1 mL 分裝保存于 -80℃。

 

檢測培養(yǎng)基

稱取9.4g  Himedia葉酸測定用培養(yǎng)基(貨號:M543)干粉培養(yǎng)基溶于100mL蒸餾水,加入50mg抗壞血酸。加熱至沸騰使培養(yǎng)基*溶解。測定時,分裝至每管為5mL培養(yǎng)基(包含標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品)。加蒸餾水,使總體積達(dá)到10mL。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻,臨用前加入氯霉素 0.03 g,抗壞血酸 0.75 g和 200μL 菌株。

 

 

 

標(biāo)準(zhǔn)曲線

取 100 μg / L 的葉酸標(biāo)準(zhǔn)液用0.5% 抗壞血酸鈉溶液 1∶200 稀釋,得到 0.5 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。在 96孔酶標(biāo)板中1~12列分別加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 0 μL、0 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、80 μL、100 μL,用0.5% 抗壞血酸鈉溶液定容至 100 μL,列加入10 μL 的疊氮鈉溶液( 3% ) 作為空白對照。全板每孔加 150 μL Himedia葉酸測定用培養(yǎng)基,封膜,37℃厭氧培養(yǎng)42 h,采用免疫酶聯(lián)測定儀測定595 nm下吸光度(A)值。以葉酸濃度為自變量(X)濃度為(0、0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5)μg/L

,以乳酸桿菌生長后培養(yǎng)基 A 值為因變量(Y) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

( 5 )測定

將血漿標(biāo)本用 0.5% 抗壞血酸鈉溶液40 倍稀釋,分別在 A1,A2,A3 孔加100 μL,在 B1,B2,B3 孔加 50 μL。B 行用 0.5% 抗壞血酸鈉溶液定容至 100 μL。A1,A2,B1,B2作為測定孔,A3,B3 孔加 10 μL疊氮鈉溶液( 3% ) 作為空白對照孔。每孔分別加入 150 μL Himedia葉酸測定用培養(yǎng)基,培養(yǎng)方法同上。測各樣本生長后的吸光度值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品中葉酸含量。

 

參考文獻(xiàn)

[1] 徐文婕,曲全岡,劉建蒙.微生物法檢測血漿葉酸實驗方法評價及應(yīng)用. 中國衛(wèi)生檢驗雜志[J] 2011 , 7 (21 ): 1722-1724.

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