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PCR Clean™玻璃表面dna酶的祛除能力如何?

更新時(shí)間:2024-12-27  |  點(diǎn)擊率:179

德國(guó)Minerva Biolabs公司提供的PCR Clean™針對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的核酸污染祛除試劑,對(duì)比其濕巾和噴霧劑在常見的儀器、物品的污染祛除效果進(jìn)行了檢測(cè),并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行了詳細(xì)的闡釋。


科研人員測(cè)試了PCR Clean™和PCR Clean™Wipes對(duì)玻璃表面dna酶的祛除能力。簡(jiǎn)而言之,DNase I(1µl, 3u /µl, Applichem, Cat.;將No.A3778.0010)移液到玻璃表面風(fēng)干。接下來(lái),用干紙巾、70%異丙醇浸泡液、PCR Clean™浸泡液或PCR Clean™ Wipes擦拭。


使用基因組DNA (gDNA)標(biāo)準(zhǔn)物作為底物/指示劑,通過(guò)qPCR間接測(cè)量DNA酶的酶活性來(lái)鑒定持續(xù)的DNA酶污染。

簡(jiǎn)單地說(shuō),在擦拭步驟后,將20µl gDNA (M.gallisepticum,10^3個(gè)基因組拷貝/µl, 10mM MgCl2在PCR級(jí)水中)添加到DNA預(yù)包被的點(diǎn)上。

然后通過(guò)上下移液10次收集污染的DNase及其底物gDNA的混合物,并在37°C下孵育15分鐘,以允許酶促反應(yīng)(消化)發(fā)生。

然后通過(guò)評(píng)估m(xù)icrostart®ATMP支原體(Sartorius STEDIM Biotech) qPCR擴(kuò)增的性能來(lái)推斷由于污染DNA酶引起的相關(guān)DNA降解。作為qPCR反應(yīng)wan quan受損的參考,科研人員納入陽(yáng)性對(duì)照,采用20µl的gDNA(10^3個(gè)基因組拷貝/µl)在37℃下孵育15分鐘,獲得陽(yáng)性對(duì)照。同樣的程序用于產(chǎn)生陰性對(duì)照,不添加DNase I。


實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在用不同方法進(jìn)行去污后,通過(guò)在DNase污染點(diǎn)上添加gDNA(雞毒支原體,103 C/µl)的qPCR來(lái)評(píng)估DNase(3 U)的有效祛除率。

在qPCR之前,從污染的玻璃表面收集gDNA和DNase的混合物,并在酶反應(yīng)的**條件下孵育。當(dāng)沒(méi)有觀察到qPCR反應(yīng)受影響時(shí),認(rèn)為凈化完成。這是通過(guò)用PCR Clean™濕巾或PCR Clean浸濕的紙巾擦拭來(lái)實(shí)現(xiàn)的,正如成功擴(kuò)增摻入的gDNA所證明的那樣。

從PCR Clean™濕巾或PCR Clean浸濕紙巾處理過(guò)的表面樣本中,獲得的摻入gDNA的Ct值與陰性對(duì)照相當(dāng),在gDNA摻入之前沒(méi)有吸過(guò)DNase(表5)。

省略擦拭步驟,使用干燥的紙巾或用70%異丙醇潤(rùn)濕的毛巾,通過(guò)之前添加的DNase誘導(dǎo)gDNA大量降解(無(wú)Ct,表5)。在陽(yáng)性對(duì)照組中觀察到類似的wan quan降解,在**反應(yīng)條件下允許DNases誘導(dǎo)的DNA降解發(fā)生。圖5顯示了閾值以上的清晰擴(kuò)增曲線,僅適用于經(jīng)PCR Clean™處理的表面和陰性對(duì)照,從而證實(shí)了qPCR性能因所用祛除劑而異。


表5.使用隨后的DNA回收作為去污效率的指標(biāo),在表面清潔后殘留的DNA酶活性。該表顯示了與對(duì)照組相比,摻入DNase預(yù)涂玻璃表面的gDNA的qPCR Ct值,后來(lái)用幾種方法擦拭。通過(guò)**酶消化(陽(yáng)性對(duì)照)獲得的擴(kuò)增缺失(無(wú)Ct)表明DNA明顯依賴于DNA酶降解,阻礙了qPCR。同樣,低效的凈化方法也會(huì)導(dǎo)致qPCR受損。斑點(diǎn)靶標(biāo)的成功擴(kuò)增(在陰性對(duì)照的2 Ct值內(nèi))表明,之前污染的DNase被顯著祛除。


圖5.在應(yīng)用了幾種清潔方法后,在DNase污染的玻璃表面上添加gDNA的qPCR擴(kuò)增曲線與對(duì)照條件進(jìn)行了比較(詳見下文圖例)。



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